Sử dụng chất đáp ứng miễn dịch để kiểm soát bệnh trên động vật thủy sản

Dịch bệnh là một trong những tác nhân chính đe dọa đến ngành nuôi trồng thủy sản. Theo truyền thống, cách để kiểm soát dịch bệnh thường là sử dụng kháng sinh hay các chất hóa học khử trùng, nhưng chúng không được khuyến khích dùng vì có sự xuất hiện của các chủng kháng bệnh cũng như việc tích lũy dư lượng thuốc trong môi trường và sinh vật khác. Mặc dù vaccine rất hiệu quả trong việc chống lại bệnh ở cá nhưng chúng khá đắt, tốn thời gian và gây stress cho cá. Trong bối cảnh này, chất đáp ứng miễn dịch có thành phần tự nhiên giúp cá tôm tăng sức đề kháng với các mầm bệnh bắt đầu được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản. Sử dụng chất đáp ứng miễn dịch ngày càng được chú ý vì chúng ít độc hơn, thân thiện môi trường thiên nhiên, hoạt tính sinh học cao. Chúng đóng vai trò quan trọng đối với cá có vảy và các loài thủy sinh vật có vỏ.

Công thức cấu tạo chung của Polysaccharide.

Marine polysaccharide, một chất đáp ứng miễn dịch giúp kiểm soát mầm bệnh

Những năm gần đây, các nhà khoa học đã chú ý đến các tác dụng của polysaccharide (là phân tử carbohydrate cao phân tử gồm chuỗi dài của đơn vị monosaccharide liên kết với nhau bằng mối liên kết glycosidic) có nguồn gốc từ đại dương được gọi là Marine polysaccharide, như là một tác nhân điều trị hay sản xuất kháng sinh, chúng ít độc tố và có hoạt lực sinh học cao. Polysaccharide nói chung sẽ được phân tách dựa trên nguồn gốc riêng biệt của chúng (từ thực vật, động vật và vi khuẩn).

Ở cá, người ta đã chứng minh rằng một số chất được hấp thụ từ rong biển, chủ yếu là polysaccharide có thể tác động đến hoạt động của một số thành phần trong hệ thống miễn dịch và làm tăng khả năng miễn dịch của cơ thể với bất cứ mầm bệnh nào. Ở cá chép, nếu tiêm vào xoang bụng chất Carrageenan – một polysaccharide dồi dào có ở rong biển đỏ, sẽ làm tăng hoạt động thực bào và sức đề kháng chống lại sự nhiễm khuẩn. Ngoài ra, Sodium alginate cũng được biết đến là muối polysaccharide giúp đẩy nhanh sự di chuyển thể thực bào ở thượng thận cá chép đến khoang bụng và làm tăng khả năng thực bào khi nhiễm khuẩn V. anguillarum. Thêm vào đó, Ergosan – một polysaccharide chiết xuất từ tảo biển, chứa nhiều acid alginic sẽ làm tăng tỉ lệ bạch cầu hạt trung tính, mức độ thực bào, chất oxy hóa và sự biểu hiện của interleukins (thuộc nhóm cytokine, là chất trung gian điều hòa giữa các tế bào trong cơ thể) ở cá hồi cầu vồng. Những polysachharides khác như laminaran và β-glucan được hấp thu từ tảo nâu Laminaria hyperborea, tăng hoạt động của đại thực bào trên cá hồi.

Tương tự, Chitosan (β-(1, 4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose) là một cation polyme thu được từ quá trình deacetyl hóa (quá trình đẩy nhóm acetyl ra khỏi hợp chất) của chitin. Chitosan polysaccharide có tác dụng thúc đẩy hoạt động miễn dịch ở cá và các loài động vật thủy sản có vỏ. Ví dụ ở tôm thẻ chân trắng, việc tiêm chitin hay chitosan có thể  giúp tăngkhả năng sống sót khi nhiễm khuẩn V. alginolyticus nhờ thúc đẩytăng tế bào máu, chất oxy hóa và hoạt động thực bào. Một số báo cáo cho thấy, sự kích thích hoạt động miễn dịch của chitin hoặc chitosan thường có ở cá hồi cầu vòng, cá hôi vân, cá tráp đầu vàng. Một nghiên cứu khác của Gopalakannan và Arul so sánh giữa các chất chitin, chitosan and levamisole ở cá chép nhằm chống lại sự nhiễm khuẩn Aeromonas hydrophila trong ao, cho thấy rằng nhóm được cho ăn chitosan sẽ tăng cường hệ thống miễn dịch bẩm sinh và tỉ lệ sống sót ở cá chép. Ngoài ra, Niu cũng cho hay chitin and và dẫn xuất của mình (chitosan, chitosan oligosaccharides và N-acetyl-D-glucosamine) kích thích tăng trưởng, là chất chống oxi hóa và tình trạng chất oxy hóa trên tôm sú.

Quá trình deacetyl hóa Chitin để tạo ra Chitosan.

Fucoidan (sulfated polysaccharides) thường được tìm thấy trong tảo nâu và một số động vật không xương sống như hải sâm và nhím biển. Chúng chủ yếu gồm fucose và sulfate với lượng nhỏ galactose, xylose, mannose, và uronic acids.

Fucoidan có các tác dụng sinh học đa dạng như là thuôc chống đông máu, chống ung thư, điều hòa miễn dịch và chống viêm. Từ các hoạt động sinh học tiềm năng khác của fucoidan, Chotigeat đã tiến hành thí nghiệm về khả năng kháng virus đốm trắng của fucoidan thô chiết xuất từ Sargassum polycystum (rong mơ). Ngoài ra, khi cho tôm sú ăn fucoidan 200mg/kg trọng lượng thân trên một ngày thì tỉ lệ sống đạt 93%. Thêm vào đó, chúng còn ngăn ngừa sự tăng trưởng của các loài vi khuẩn gây hại như Vibrio harveyi, Staphylococcus aureus và Escherichia coli. Tương tự, Immaunel cho biết fucoidan từ rong mơ Sargassum wightii làm giảm tỉ lệ chết lên đến 68.06% và tăng cường các thông số miễn dịch như: THC (số lượng tế bào máu), hoạt động của enzyme prophenoloxidase, chất oxy hóa, enzyme superoxide dismutase (là một enzyme làm trung hòa gốc tự do) và hoạt động thực bào. Sivagnanavelmurugan cũng dùng fucoidan từ rong mơ Sargassum Wightii cho ấu trùng Artemia ăn (400mg/L) và dùng Artemia cho tôm sú ăn sẽ giảm tỉ lệ chết còn 61.6% và chống lại sự nhiễm bệnh đốm trắng. Ở thí nghiệm của Marudhupandi and Ajith Kumar, fucoidan chiết xuất từ Turbinaria cho thấy tiềm năng kháng khuẩn trên bệnh cá cảnh biển như Aeromonas hydrophila, Enterobacter sp., Pseudomonas aeruginosa, treptococcus sp., Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica and Proteus sp. Marlowe cũng tiến hành điều tra khả năng điều hòa miễn dịch của alginic và fucoidan, cả hai chất trên đều có nguồn gốc từ rong nâu. Gần đây Kitikiew cho hay fucoidan có khả năng kích thích miễn dịch bẩm sinh của tôm thẻ chân trắng và khả năng chống lại khuẩn V. alginolyticus.

Cấu tạo của Fucoidan.

Alginic acid là một polysaccharide anion nổi tiếng và phân bố chủ yếu ở thành tế bào của tảo nâu. Axit alginic là một chất đồng trùng hợp tuyến tính với các khối homopolymeric của (1-4) liên kết-D-mannuronate (M) và epime C-5 của nó dư lượng α-L-guluronate (G), tương ứng, liên kết cộng hóa trị với nhau trong các chuỗi hoặc khối khác nhau. Các đơn phân có thể xuất hiện trong các khối đồng nhất của dư lượng G liên tiếp (khối G), dư lượng M liên tiếp (khối M) hoặc dư lượng M và G xen kẽ (khối MG).

Chỉ một số hoạt động miễn dịch alginic acid được công bố. Ở cá, alginic acid làm tăng hoạt động của tế bào thực bào thượng thận và sự di chuyển của chúng từ vị trí tiêm bởi sự tăng sản xuất các yếu tố hóa học và độ nhạy cảm của chúng. Tiêm xoang bụng Ergosan (chứa 1% alginic acid) sẽ làm tăng tế bào bạch cầu trung tính, mức độ thực bào và hoạt động kích ứng oxy ở cá Hồi Vân cũng như sự biểu hiện của interleukins (IL-1b) và chemokines. Tuy nhiên, nó không có tác dụng đối với lysozyme và hoạt động chống lại protease khi quá khoảng thời gian 7 ngày. Alginic acid và Fucoidan có thể điều chỉnh phản ứng của tế bào đặc biệt là chất oxy hóa và leukocytes thượng thận ở cá Tuyết Đại Tây Dương. Như vậy, từ những cơ sở trên cho thấy polysaccharide có thể được sử dụng để phát triển thành những liệu pháp như đáp ứng miễn dịch hoặc thuốc kiểm soát bệnh thủy sản.

Theo Thangapandi Marudhupandi và Dhinakarasamy Inbakandan.

Kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản vì chúng có vai trò thúc đẩy sự tăng trưởng và ức chế các bệnh do vi khuẩn gây ra. Khi diện tích nuôi trồng lớn, đi kèm với đó là việc lạm dụng kháng sinh ngày càng nghiêm trọng.

Sử dụng kháng sinh là nguyên nhân quan trọng dẫn đến ô nhiễm nguồn nước, xuất hiện các gen kháng kháng sinh (gen kháng thuốc) làm cho việc kiểm soát mầm bệnh càng khó khăn hơn. Hơn nửa vi khuẩn kháng đa kháng sinh cũng xuất hiện. Do đó, các gen kháng thuốc được các nhà nghiên cứu rất chú ý.

Những năm gần đây, ngành nuôi trồng thủy sản đã mở rộng quy mô và diện tích cũng như ngày càng tiến bộ trong các nghiên cứu chuyên sâu. Hai hệ thống nuôi điển hình là nuôi thâm canh tuần hoàn nước và nuôi tự nhiên theo hình thức quảng canh. Nước thải với hệ thống tuần hoàn sẽ được tái sử dụng thông qua hệ thống xử lý. Còn trong hệ thống nuôi quảng canh, nước xử lý đơn giản hơn và thải trực tiếp ra môi trường.

Hệ thống nuôi tuần hoàn đã trở thành một mô hình nuôi điển hình phổ biến hiện nay. Với lợi thế sử dụng ít nước, kiểm soát các điều kiện nuôi chặt chẽ, hệ thống nuôi tuần hoàn ven biển đã được đánh giá rất cao. Nhờ lợi thế nước chỉ tuần hoàn trong hệ thống mà không xả ra bên ngoài hoặc xả ra rất ít nên các hệ thống nuôi tuần hoàn được coi là phương pháp quan trọng để ngăn chặn sự ảnh hưởng của kháng sinh và các gen kháng thuốc. Vì kháng sinh được sử dụng rộng rãi để phòng ngừa dịch bệnh và sử dụng như chất phụ gia thức ăn để thúc đẩy tăng trưởng cho vật nuôi.

Một loạt gen kháng thuốc đã được phát hiện trong nhiều hệ thống nuôi khác nhau và cũng không ngoại trừ hệ thống tuần hoàn nước. Liệu rằng công nghệ xử lý nước trong hệ thống này có làm giảm sự xuất hiện của gen kháng thuốc hay không và các gen này có gây mối đe dọa lớn cho môi trường không?

Để giúp bù đắp một số kiến thức về gen kháng thuốc, nghiên cứu này được thực hiện để điều tra sự phân bố của gen kháng thuốc trong một hệ thống nuôi thủy sản ven biển. Phương pháp PCR được sử dụng để định lượng, phân tích mức độ lan truyền cũng như cung cấp một số lý thuyết hỗ trợ đánh giá việc ảnh hưởng của môi trường đến hệ thống nuôi và phát triển được công nghệ điều trị gen kháng thuốc.

Phương pháp và vật liệu

Các mẫu được thu thập từ một hệ thống nuôi trồng thủy sản tại thành phố Yên Đài, nơi chiếm 1/6 sản lượng hệ thống nuôi thủy sản ven biển ở Trung Quốc. Đây là các mẫu nước nuôi cá hồi Đại Tây Dương, nuôi tuần hoàn 90%, khử trùng bằng tia UV để loại bỏ một phần vi khuẩn trước khi cho vào ao. Các mẫu sau đó thu thập từ hệ thống tuần hoàn được đánh dấu từ R1 đến R7, R1 đến R6 là những mẫu nước nuôi, mẫu chiết tách protein và mẫu nước trong bộ lọc sinh học được chọn lọc, R7 là mẫu phân và thức ăn thừa được tách chiết protein.

Nghiên cứu được thực hiện theo các bước: Ly trích DNA với nồng độ tinh khiết cao, sau đó xét nghiệm PCR để phát hiện gen kháng thuốc. Tiếp theo chuẩn bị thêm 30 gen kháng thuốc bao gồm 3 gen kháng sulfonamid, 18 tetracycline, 4 quinolone và 5 gen kháng macrolide. Sử dụng phương pháp PCR và real time PCR để định lượng gen kháng thuốc. Sau đó giải trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn từ các mẫu DNA chiết xuất và khuếch đại chúng lên nhiều lần. Các mẫu kháng sinh được phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng sau đó tách chiết, phân tích và định lượng. Cuối cùng là phân tích thống kê để xác định mối quan hệ giữa vi khuẩn, kháng sinh và các gen kháng thuốc.

Kết quả và thảo luận

Trong số 30 gen kháng thuốc thử nghiệm thì có 10 gen được phát hiện có hàm lượng cao trong tất cả các mẫu thủy sản. Ở các khu vực nuôi có nhiệt độ khác nhau thì các gen kháng thuốc xuất hiện với tần xuất khác nhau. Các gen kháng sulfonamid là phong phú nhất, có trong tất cả các mẫu, đồng thời phát hiện trong các mẫu trầm tích đáy sông. Kế tiếp là quinolone cũng phát hiện với lượng lớn trong tất cả các mẫu.

Gen Int1 đóng vai trò quan trọng trong sự lan truyền gen kháng thuốc theo chiều ngang giữa các vi khuẩn, nó như các vector truyền. Int1 được tìm thấy rất nhiều trong các trại nuôi. Điều đó cho thấy rằng khả năng lan truyền của các gen kháng thuốc trong trại nuôi là rất lớn.

Nồng độ kháng sinh quinolone, tetracycline và marcrolide trong nước thử nghiệm tương đối cao, chứng tỏ là chúng đã bị kháng lại trong quá trình xử lý nước. Các kháng sinh có mối tương quan với nhau, tuy nhiên không tìm thấy sự tương quan rõ ràng giữa kháng sinh và các gen kháng kháng sinh tương ứng. Nên sự xuất hiện của chúng được suy ra bởi nhiều yếu tố, không chỉ do việc lạm dụng kháng sinh. Sự xuất hiện này cũng được chứng minh là do biến động của một vài yếu tố trong môi trường như P, NH3, NO2, tổng carbon. Theo phân tích cho thấy sự tăng cường tích lũy gen kháng thuốc có thể do sự gia tăng các yếu tố trên trong nước.

Mẫu R7 và nước trong bộ lọc sinh học là các mẫu có hàm lượng gen kháng thuốc nhiều nhất. Do đó, mùn bã hữu cơ đáy ao là nơi dự trữ lớn của nguồn gen này. Và nước trong bộ lọc sinh học là nơi sản sinh quan trọng nhất của chúng. Kiểm tra các mẫu còn lại cho thấy nước nuôi và mẫu tách chiết protein không phải là nơi tăng hàm lượng chính của các gen kháng thuốc. Một số báo cáo trước đây cho thấy rằng việc khử trùng nước bằng Clo và UV sẽ loại bỏ được gen kháng thuốc và các vi khuẩn.

Gen Int1 trong mẫu phân và thức ăn thừa là phong phú nhất. Do đó, sự lan truyền là rất dễ dàng. Các gen này ở nước tầng đáy sẽ cao hơn nước tầng giữa và tầng mặt. Các hệ thống nuôi thương phẩm là nơi dễ sinh ra các gen này. Ngoài ra cũng phát hiện các gen Int1 không sinh ra được trong quá trình ương giống của cá hồi.

Quan điểm

Sử dụng bừa bãi thuốc kháng sinh là nguyên nhân làm xuất hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc, tuy nhiên cần hiểu đúng là kháng sinh và gen kháng thuốc không có nhiều mối tương quan, mà vi khuẩn mới chính là nguyên nhân sinh ra gen kháng thuốc. Vì vậy, dù không sử dụng kháng sinh, nhưng trong hệ thống nuôi tuần hoàn vẫn xuất hiện vi khuẩn kháng thuốc. Nghiên cứu cho thấy, khi nuôi tuần hoàn vi khuẩn kháng thuốc sẽ tích lũy một cách đáng kể trong phân và thức ăn ở lớp mùn bã hữu cơ đáy ao. Bên cạnh đó, việc giảm khử trùng bằng tia UV khiến các bộ lọc nước sinh học trở thành nơi sinh ra nhiều gen kháng thuốc nhất.

Nghiên cứu mang lại cái nhìn sâu hơn về vấn đề kháng thuốc trong nuôi thủy sản, từ đó giúp cải thiện các phương thức canh tác hiện tại cũng như phát triển mô hình nuôi mới trong tương lai.

Theo Jian-Hua Wang và cộng sự.